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RFLP分析要求所选择的限制酶活性稳定。昆山亲子鉴定常用的限制酶有Hinf I、HaeⅢ和PsLI等。各种限制酶的最适反应条件各不相同，通常生产厂家会提供反应缓冲液，并在产品说明书上写明反应条件。酶反应体系一般以Tris-HCl(pH 7.4)为缓冲体系．限制酶需要M酽+离子的激活。酶用嚣按照每lLrg样本DNA用酶3—5 U设镒。反应温度通常为37℃，酶切时问3～5h。
昆山亲子鉴定样本DNA必须被完全酶切，否则将会影响分型结果。导致基因组DNA酶切不完全的常见原因有：酶活性下降、样品DNA不纯、含有酪活性抑制物、反应体系配制不当、酶用量偏少、反应时间不够等。限制酶消化不完全的样本DNA必须盈新酶切。
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